206 - Organismes vivants

Les bactéries multirésistantes aux antibiotiques sont des problèmes majeurs en santé. L’acquisition de gènes de résistance peut se faire de plusieurs façons. Le processus le plus dangereux est via la conjugaison d’éléments génétiques mobiles entre bactéries. Les biofilms sont des communautés bactériennes encastrées dans une matrice extracellulaire. Ils sont ubiquitaires de l’environnement cause de nombreux problèmes en santé où la majorité des infections chroniques bactériennes sont causées par des bactéries sous forme de biofilms. Malgré l’omniprésence des biofilms dans des environnements fréquemment exposé à des antibiotiques, leur rôle dans le transfert d’éléments génétiques mobiles n’a quasiment pas été étudier. Dans mon projet, j’étudie le transfert conjugatifs d’un élément intégratif et conjugatif (ICEBs1) et le rôle du biofilm permettant d’améliorer l’efficacité de transfert entre des bactéries. J’ai utilisé une approche génétique en combinaison avec des techniques de microscopie à fluorescence me permettant de suivre le transfert de ICEBs1 dans le biofilm. Mes résultats montre que le transfert s’effectue dans des «îlots» où la conjugaison est très efficace. Ils suggèrent aussi que les bactéries ayant reçu ICEBs1 soit impliquer par la suite dans son transfert, un phénomène peu répertorié. Mon projet permettra de mieux comprendre le rôle du biofilm dans la transmissions de gènes de résistance dans le but de diminuer l’apparitions de bactéries multirésistantes.

Les bactéries sont capables de croître sous forme de communautés complexes, les biofilms. Ils confèrent une résistance accrue aux antimicrobiens et sont capables de croître sur une grande variété de surfaces, ce qui impacte l’Homme dans divers contextes. 80% des infections sont issues de bactéries produisant des biofilms et ils peuvent, en milieu médical, entraîner des infections chroniques. C’est le cas des jeunes patients atteints de fibrose kystique, chez lesquels se développe un biofilm de Staphylococcus aureus, une bactérie à Gram positif.

La biosynthèse de novo de certains composés impliqués dans la formation de biofilm semblent prometteuses à cibler pour diminuer la formation de biofilms de pathogènes à Gram positif. Ces voies pourraient devenir une cible thérapeutique intéressante pour développer des thérapies, améliorant l’efficacité des antibiotiques et évitant le développement de résistances.

Aujourd’hui, les connaissances sur les bactéries à Gram positif restent limitées du fait du peu d’outils de modifications génétiques disponibles pour ces organismes. Pour résoudre cette problématique, l’utilisation du système d’ICEBs1, l’ICE de Bacillus subtilis, pourrait être une alternative. En effet, B. subtilis est une bactérie modèle fréquemment utilisée en laboratoire car elle est très bien caractérisée et possède de grandes capacités de formation de biofilm. Le système d’ICEBs1 pourrait alors servir à mobiliser un plasmide porteur du système CRISPR-Cas9.

Les bactéries dépendent des protéines transmembranaires afin d’échanger molécules et signaux avec l’espace extracellulaire. La composition protéique des membranes bactériennes doit être adaptée rapidement aux conditions environnementales afin d’assurer la survie des cellules.  Afin d’atteindre ce niveau de régulation fine, les bactéries ont développé un nombre impressionnant de mécanismes contrôlant la synthèse et l’assemblage de ces protéines. Parmi ceux-ci, les petits ARN régulateurs (sRNA) sont utilisés afin de réguler post-transcriptionnellement l’expression des protéines membranaires. Les sRNA sont des ARN non-codants régulant leurs ARNm cibles via des appariements ARN:ARN.  Chez Escherichia coli, le sRNA MicF est connu pour réguler quatre ARNm encodant des protéines membranaires. Cependant, considérant les nombreux stress induisant son expression, son targetome est étonnement restreint et son impact cellulaire encore peu défini. Grâce à une technique de capture d’ARN in vivo suivi de séquençage à haut-débit, nous avons pu dévoiler le targetome étendu de MicF et identifier l’ARNm oppA comme étant une cible positive. En plus de son rôle essentiel dans l’import des oligopeptides, la protéine OppA est un facteur de pathogénicité, ce qui en fait une cible de choix à étudier. Nos travaux démontrent que l’ARNm oppA est positivement régulé par MicF via un nouveau mécanisme de régulation non canonique impliquant deux régulateurs négatifs de oppA, le sRNA GcvB et la protéine Hfq.

Au Collège Vanier, des étudiants se sont engagés dans un projet d’ingénierie génétique de cellules de levure avec un gène impliqué dans la production d’un médicament appelé noscapine. (S)-candine est un des précurseurs de la noscapine, un antitussif ayant le potentiel de supprimer les tumeurs. La production de ce composé moléculaire est limité par un faible taux de synthèse dans le pavot à opium. Récemment, des efforts pour exprimer les gènes de la production de noscapine dans des microorganismes ont lieu dans des laboratoires de compagnies pharmaceutiques. Dans ce projet, l’efficacité de 12 gènes orthologues de plantes ont été évaluées pour leur capacité à produire la (S)-canadine chez la levure Saccharomyces cerevisiae en  présence de la canadine-synthase du pavot à opium. Les donnés démontrent des différences dans l’expression et l’éfficacité des 12 orthologues. Le travail de biologie moléculaire a été effectué au collège et était relativement peu couteux. La microscopie à fluorescence, la spectrométrie de masse et la cytométrie en flux ont été réalisées dans des installations universitaires. Ce projet a été une occasion pour les étudiants de cégep de se lancer dans de nouvelles recherches.

La transporteur Str3 est requis pour l’acquisition d’hème exogène chez la levure Schizosaccharomyces pombe. En conditions de carence en fer, l’expression de Str3 est activée et la protéine se localise à la surface cellulaire pour médier son activité de transport. En utilisant une approche protéomique couplée à la spectrométrie de masse, les résultats ont permis d’identifier que la protéine Tpx1 interagit spécifiquement avec le transporteur Str3 et ce, de manière hème-dépendante. Cette interaction Str3-Tpx1 a été confirmée en utilisant d’autres méthodes telles la coimmunoprécipitation et la fluorescence bimoléculaire. En absence de Tpx1, la croissance hème-dépendante des cellules est grandement diminuée, suggérant un rôle important pour Tpx1 au niveau de la distribution de l’hème à d’autres hémoprotéines intracellulaires. Des essais biochimiques ont montré que Tpx1 s’associe à l’hème avec une constante de dissociation à l’équilibre (Kd) de 0.26 uM. Une carence en fer provoque également l’induction de l’expression de la sulfirédoxine Srx1. Des essais d’immunoprécipitation ont montré que Srx1 interagit avec Tpx1, favorisant la réduction de Tpx1 par Srx1. Une fois réduite, Tpx1 aurait davantage de propension à se lier à l’hème. Collectivement, ces résultats révèlent la participation de deux nouvelles protéines, Tpx1 et Srx1, pour l’acquisition de l’hème exogène, qui lui, est un facteur de virulence chez les espèces fongiques.

La levure Schizosaccharomyces pombe utilise 3 mécanismes différents pour acquérir le fer de l’environnement. L’un de ces mécanismes consiste à synthétiser un sidérophore, le ferrichrome, et l’excréter sous sa forme apo. Une fois excrété, le ferrichrome capte le fer environnemental puiset il est récupéré par la levure pour le fonctionnement de ses propres métalloenzymes. Bien que la levure Saccharomyces cerevisiae est incapable de synthétiser des sidérophores, elle exprime à sa surface le transporteur Arn1, qui lui, est capable d’assimiler le ferrichrome de l’environnement. Les résultats montrent que les cellules de S. cerevisiae qui expriment Arn1 acquièrent des sidérophores de S. pombe pour leur croissance. Aucune croissance de S. cerevisiae n’est possible lorsque la souche de S. pombe est délétée pour les gènes sib1⁺ et sib2⁺ codant pour la biosynthèse de ferrichrome. L’utilisation de ce système de "cross-feeding" a permis l’identification de sib3⁺, un nouveau gène chez S. pombe, qui lui, est également requis pour la synthèse de ferrichrome et la co-culture de S. cerevisiae avec S. pombe lorsque la seule source de fer est le ferrichrome. Collectivement, ces résultats révèlent la capacité de S. pombe à sécréter des sidérophores et à permettre à d’autres espèces de levures d’en tirer profit pour envahir de nouvelles niches pauvres en fer.

La dérégulation de l'autophagie, processus catabolique permettant le recyclage de composés intracellulaires par les lysosomes, peut participer au développement de pathologies inflammatoires chroniques de l'intestin. La myotubularine Sbf active la petite GTPase Rab21 pour induire le trafic de la protéine lysosomale Vamp7, nécessaire à la fusion entre les autophagosomes et les lysosomes, contrôlant ainsi le flux autophagique. Nous supposons qu’une autophagie dysfonctionnelle causée par la perte de Sbf perturbera l’homéostasie intestinale. Comme chez les mammifères, l’intestin de drosophile est composé de cellules souches qui se divisent en progéniteurs spécifiques qui se différencient en entérocytes, cellules absorbant les nutriments  ou en entéroendocrines, cellules sécrétrices d’hormones. La co-expression d'ARN interférents avec la GFP spécifiquement dans les cellules souches intestinales et/ou les progéniteurs chez la drosophile adulte permet leur quantification. La perte de Sbf  uniquement dans les cellules souches ou dans les pré-entérocytes induit une augmentation de cellules entéroendocrines. Une méthode de traçage cellulaire a montré que la déplétion de Sbf, Rab21 ou Vamp7 dans les cellules souches et les progéniteurs induit une augmentation significative des pré-entéroendocrines et des entéroendocrines nouvellement formées. Ainsi, la perte de Sbf ou Rab21 favorise la détermination de la cellule en entéroendocrine et semble dépendre de leur fonction dans l’autophagie.

Un nouveau type de biocapteurs basé sur un circuit électronique ultra-miniaturisé offre une sensibilité accrue pour mesurer la cinétique de biopolymères tels que les protéines et les brins d’ADN. Ce biocapteur repose sur l’utilisation d’un nanotube de carbone auquel est greffé, par liaison covalente, le biopolymère d’intérêt. L’expérience montre que la conductance du nanotube est corrélée à la structure et à la cinétique du biopolymère, mais certaines questions persistent. Quelles sont les interactions entre le biopolymère et le nanotube ? Ces interactions affectent-elles la stabilité structurelle du biopolymère ? La cinétique de ce dernier est-elle en partie affectée par ces interactions ? Pour y répondre, nous employons des simulations de dynamique moléculaire afin de caractériser la stabilité du motif G-quadruplex, pour lequel nous avons des données expérimentales avec le biocapteur, lié à un nanotube de carbone. Nos résultats montrent que la stabilité structurelle du G-quadruplex n’est pas significativement affectée par la présence du nanotube. Cependant, nous avons identifié certaines interactions avec le nanotube qui pourraient affecter la cinétique de son repliement. Nous effectuons donc des simulations basées sur des techniques d’échantillonnage avancées afin de renforcer nos conclusions. À terme, ces résultats permettront, avec nos collaborateurs en laboratoire, d’identifier et de mettre en application des stratégies afin d’améliorer la sensibilité du biocapteur.

La technologie d'électro-activation en solution s'est avérée une méthode très efficace de conversion du lactose en lactulose. Le rendement de lactulose par électro-activation d'une solution de lactosérum de 10% à 800 mA pendant 60 min a atteint 30-40% et reste au même niveau après l’ajustement du pH à 7. L'incorporation de poudre de lactosérum électro-activé (LEA) dans du lait fermenté a été étudiée en utilisant les ferments commerciaux YC-381 (Fromagex, Canada) et CHOOSIT Kefir (Danisco, Danemark). Les résultats ont révélé que l'ajout de LEA dans le lait induit une plus longue durée de la phase Lag de fermentation lorsqu'il est ajouté à une concentration de 9 % (p/p), comparativement au lactosérum non traité. Les laits fermentés à base de LEA ont moins de synérèse, ce qui est en accord avec leur microstructure moins poreuse et plus homogène. L'ajout de LEA donne un gel de kéfir moins visqueux, ce qui en fait un bon candidat pour l'ajout dans les produits buvables. L'ajout de LEA aux produits laitiers fermentés a entraîné une augmentation de la production d'AGCC. Le compte bactérien total était plus élevé dans le lait fermenté additionné de LEA. En outre, les laits fermentés préparés avec un ajout de LEA ont conservé une partie de lactulose après fermentation (55%) et pendant le stockage de 2 semaines (50%).  Les propriétés susmentionnées du LEA en font un nouvel ingrédient laitier ayant le potentiel d'un additif alimentaire fonctionnel et prébiotique.