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Le sérum stimule la production de microparticules par les myofibroblastes: évaluation des protéines impliquées
Akram Ayoub (LOEX - Laboratoire d'Organogénèse EXpérimentale.), Alain GARNIER , Lise LEMIEUX , Sébastien LAROCHELLE , Véronique MOULIN
Les microparticules (MP) sont des vésicules qui contiennent des protéines, des lipides et des ARN. Elles sont produites par les myofibroblastes (cellules spécialisées apparaissant lors de la cicatrisation) en présence de sérum humain ou bovin. Ces MP ont une action promitotique sur les cellules endothéliales et fibroblastiques et peuvent donc jouer un rôle au cours de la cicatrisation. Notre but est de définir les protéines sériques impliquées dans la stimulation de la production des MP par les myofibroblastes. Pour cela, différentes techniques de séparation biochimiques des protéines sériques ont été utilisées : une chromatographique dite proteominer®, une chromatographie sur un échangeur fort d'anions, et une technique de précipitation des protéines avec différentes concentrations de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4. Les extraits de sérum bovin obtenus par ces techniques ont été mis en contact avec des myofibroblastes pendant 24h. Les cellules et le milieu de culture sont ensuite récupérés et la quantité de MP produites est évaluée par cytométrie en flux. Parmi les extraits obtenus, certains ont démontré une capacité à stimuler la production des MP permettant d’éliminer les protéines non pertinentes. Une analyse par spectroscopie de masse sera faite sur ces extraits afin de déterminer la ou les protéine(s) à l`origine de la production des MP par le sérum. Ces résultats permettront une meilleure compréhension des interactions entre les cellules au cours de la cicatrisation.
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Expression des lipoxygénases dans l’épiderme humain
Lorraine Andrée Parent (LOEX), Véronique MOULIN , Jadson MOREIRA-PEREIRA , Lucie GERMAIN , Bernard FRUTEAU-DE-LACLOS
La famille des lipoxygénases (LOX) est impliquée dans la transformation d’acides gras afin de maintenir l’équilibre homéostatique de la peau. Les atteintes cutanées telles qu’ichthyoses et psoriasis reflètent l’importance d’une expression adéquate des LOX épidermiques. L’objectif spécifique de ce projet était de préciser la localisation des quatres LOX épidermiques humaines principales: 12R-LOX, E-LOX3, 12-LOX et15-LOX-2. Les zones d’homologie des LOX ont été considérées pour la sélection des anticorps afin qu’ils demeurent spécifiques à une lipoxygénase au cours des réactions d’immunofluorescence indirecte. Des coupes de peau normale humaine de 5 um préparées au cryostat ont été utilisées. Les LOX sont retrouvées dans toutes les couches cellulaires de l’épiderme avec différentes intensités. Chaque LOX a cependant une localisation spécifique au niveau des cellules; E-LOX3 nucléaire, 12R-LOX cytoplasmique, 15-LOX-2 membranaire et pour 12-LOX membranaire puis cytoplasmique. Ces résultats montrent que les LOX impliquées dans les anomalies de la couche cornée sont présentes dès la couche basale. Nous poursuivons nos travaux avec des peaux reconstruites par génie tissulaire ainsi qu’avec des cultures cellulaires en monocouche de cellules épidermiques humaines dans le but d’étudier les facteurs modulant l’expression et la localisation subcellulaire des LOX. Nos recherches tendent vers le mieux-être des patients atteints de maladies dermatologiques dont l’ichthyose et le psoriasis.
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Protéines présentes dans les microparticules produites par des myofibroblastes cicatriciels
Amélie Langlois (Université Laval), Sébastien LAROCHELLE , Samir SIAGH , Hervé GENEST , Véronique MOULIN
La production de microparticules (MP) par les myofibroblastes (Wmyo) humains apporte de nouvelles perspectives dans le domaine de la communication entre les cellules lors du processus normal de cicatrisation. Six populations de Wmyo ont été cultivées afin de récolter des MP, et les protéines des MP ont été séparées par le 2D-DIGE (2-Dimensional Differential in-Gel Electrophoresis). L’utilisation du marquage des protéines par des molécules fluorescentes nommées Cydye a permis de distinguer, lors de l’analyse, les protéines intra et extra vésiculaires. L’acquisition des images des six gels a requis le système Typhoon Mode Imager et le logiciel Delta2D les a analysés. La recherche de protéines très conservées et constantes entre les MP des six populations de Wmyo était l’objectif de ce volet. Grâce au logiciel Scaffold Viewer, 133 points furent analysés par spectrométrie de masse pour identification. Le résultat : 292 protéines différentes, avec un minimum de 95% de probabilité que le peptide qui a servi à l’identification soit unique à la protéine. Une grande variété des protéines comme la lactadhérine, l’annexine 5, la filamine-A ainsi que plusieurs enzymes telles que la déshydrogénase de la L-lactate et l’aldolase fructose-diphosphate et une importante proportion de protéines liées au cytosquelette ont été répertoriée. Cette analyse du protéome des MP de Wmyo permettra d’améliorer nos connaissances sur la communication entre les cellules au cours de la guérison des plaies.
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Rôle de l’interleukine 1 alpha dans la formation des cicatrices hypertrophiques
Jadson Moreira Pereira (Université Laval), Véronique MOULIN , Lorraine Andrée Parent (LOEX)
La cicatrisation est un processus étroitement régulé, impliquant une réponse cellulaire et la sécrétion de plusieurs facteurs solubles, dont l’interleukine 1 alpha (IL-1a) qui a un rôle très important. Une défaillance de ce processus conduit à la formation des cicatrices hypertrophiques (Hscars), un désordre fibroprolifératif caractérisé par un dépôt excessif de collagène. Des auteurs ont émis l’idée que l’IL-1a (une cytokine inflammatoire) aurait un rôle antifibrotique non négligeable, mais cela demeure un sujet controversé dans la littérature. Pour démontrer l’action antifibrotique d’IL-1a, la technique de génie tissulaire par auto-assemblage a été utilisée. Des équivalents dermiques ont été produits en présence ou non d’IL-1a (1 ng/mL) ou de TGFB1 (1 ng/mL, contrôle positif). Ces dermes traités pendant 21 jours ont subi des procédures d’histologie pour permettre la mesure de leurs épaisseurs, un paramètre-clé pour évaluer la fibrose. Les résultats montrent une différence significative entre l’épaisseur des dermes construits en présence d’IL-1a par rapport aux contrôles. De plus, l’ajout d’un inhibiteur d’IL-1a (IL-1Ra) lors de la formation du derme entraine une augmentation de l’épaisseur de derme. Une analyse de la production de collagène et des MMP montre également une bonne corrélation avec ce résultat. Ceci soutient l’hypothèse du rôle antifibrotique d’IL-1a. Ces observations apportent de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des Hscars.
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Imagerie du réseau de capillaires formé dans les tissus humains reconstruits par génie tissulaire
Kim Aubin (Université Laval), Caroline VINCENT , Dominique MAYRAND , Maryse PROULX , Julie FRADETTE
La greffe de tissus adipeux reconstruits par génie tissulaire (TAR) comportant un réseau préformé de capillaires représente une alternative intéressante à la greffe autologue de gras en chirurgie de reconstruction. Notre objectif est de caractériser le réseau de capillaires formé in vitro dans les TAR et de le comparer à celui retrouvé dans les tissus conjonctifs reconstruits (TCR), produits avec les mêmes populations cellulaires non différenciées en adipocytes. Le dosage par ELISA de molécules bioactives sécrétées par les tissus, pouvant agir sur le réseau, a montré des niveaux supérieurs de leptine (30 fois), d’angiopoïétine-1 (3.8 fois) et de VEGF (1.7 fois) dans les TAR lorsque comparés aux TCR. La détection de PECAM-1 par immunofluorescence indirecte a permis de mettre en évidence les capillaires formés dans les tissus lors de l’analyse in toto par microscopie confocale. Les résultats préliminaires montrent que le nombre de structures capillaires présentes dans les tissus ne varie pas entre les TAR et les TCR, mais certaines différences sont observées au niveau morphologique entre les réseaux. De plus, la majorité (>70%) des capillaires mesurés dans les tissus reconstruits in vitro ont des diamètres moyens comparables aux capillaires observés dans des échantillons de gras natif humain (entre 8 et 20 µm). Ce modèle prometteur au niveau clinique serait également intéressant dans l’étude des molécules influençant l’angiogenèse.
Supporté par les IRSC.
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Développement d’un échafaudage de matrice extracellulaire structuré pour la reconstruction de la media par génie tissulaire
Jean-Michel Bourget (Université Laval), Robert GAUVIN , Maxime GUILLEMETTE , Véronique LATERREUR , Jean RUEL , François A. AUGER , Teodor VERES , Lucie GERMAIN
Le LOEX a développé la méthode d’auto-assemblage permettant de fabriquer des tissus sans biomatériaux, en utilisant la capacité des cellules à produire leur propre matrice extracellulaire (MEC). Contrairement aux fibroblastes, les cellules musculaires lisses (CML) de la media ne sont pas de bonnes productrices de MEC, résultant en un tissu peu résistant. Nous avons récemment développé une nouvelle méthode pour palier à ce problème. Les fibroblastes dermiques produisent de la MEC avant d’être lysés. Les CML sont ensuite ensemencées dans cette MEC avant d’être roulées sur un mandrin pour former un tube, résultant en une media plus résistante et plus contractile. Dans la présente étude, nous avons combiné cette approche avec l’alignement des cellules et de la matrice par guidage topographique afin d’augmenter la résistance du substitut vasculaire. Nous avons comparé la résistance à la traction et la capacité contractile des substituts produits avec les différentes techniques. L’alignement du feuillet classique augmente la résistance mécanique et la contraction du substituts. Lorsqu’on utilise un feuillet de MEC fibroblastique aligné circonférentiellement comme échafaudage pour l’ensemencement des CML, la résistance mécanique augmente, mais la capacité contractile reste inchangée par rapport à l’utilisation du même type de matrice, mais non alignée. Cette amélioration permettra la production d’une media vasculaire plus résistante à partir des cellules du patient.
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Optimisation des peaux humaines reconstruites par génie tissulaire : réduction du temps nécessaire à la production
Maxime Desgagné
(Laboratoire d'Organogenèse expérimentale (LOEX/CMDGT)),
Lucie Germain (Université Laval), Amélie LAVOIE
, Rina GUIGNARD
, François A. AUGER
, Véronique MOULIN
, Lucie GERMAIN
La technique d’auto-assemblage du LOEX permet de produire des substituts cutanés très prometteurs pour le traitement des grands brulés et des plaies chroniques. Le temps de production (45 jours) pourrait être amélioré. Nous proposons un protocole alternatif qui diffère par le moment où les kératinocytes sont ensemencées sur les dermes reconstruits. Hypothèse : les substituts cutanés seront de même qualité et les cellules souches seront conservées tout en diminuant le temps de production de 7 jours. Méthode présentement utilisée : mise en culture en flacon de fibroblaste et kératinocytes. Lorsque manipulables, il y a superposition de 3 feuillets de fibroblastes, ensemencement de kératinocytes sur le feuillet supérieur et mise en culture submergée pour permettre la prolifération des kératinocytes. Il y a ensuite maturation de la couche cornée par la mise en interface air-liquide. La nouvelle méthode testée : ensemencement de kératinocytes sur un des trois feuillets de fibroblastes, avant l’empilement. Nous éliminons ainsi l’étape de culture submergée de la peau reconstruite et diminuons le temps de production de 7 jours. Histologie : les peaux sont de même qualité. Des études en immunohistochimie et en microscopie électronique afin d’observer l’ultrastructure des peaux, le niveau de différenciation cellulaires et la présence de cellules souches sont en cours. Cette nouvelle méthode est très prometteuse et permettrait un traitement plus rapide des grands brulés.
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Impact de l’aldostérone et du spironolactone sur l’élastogénèse dans un substitut cutané produit par génie tissulaire
Benjamin Goyer (Université Laval), Ulysse PEREIRA , Sarah SAUVÉ , Ludovic MARTIN , Lucie GERMAIN
La méthode d’auto-assemblage permet de concevoir des peaux reconstruites bilamellaires (épiderme/derme) autologues par la capacité des fibroblastes dermiques à produire et à assembler leur propre matrice extracellulaire en présence d’acide ascorbique. Bien que présentant de bonnes propriétés élastiques, ce modèlepossède peu ou pas de réseau de fibres élastiques matures. Le but de ce travail était donc de développer un substitut cutané in vitro par génie tissulaire permettant d’étudier la maturation et l'organisation du réseau de fibres élastiques. Différents substituts ont été reconstruits en utilisant l’approche d’auto-assemblage du LOEX (Figure 1). L’élastogénèse est induit en activant la voie de l’Insulin-like growth factor-I par l’aldostérone et la spironolactone.L’analyse immunohistochimique a révélé une expression forte de la fibrilline-2 et faible de l’élastine dans le derme des substituts cultivés en présence d’acide ascorbique (contrôle), tandis qu’une augmentation de l’intensité de l’élastine et une diminution de la fibriline-2 a été observée dans la dernière phase de culture en présence combinée d’acide ascorbique, d’aldostérone et de spironolactone. De plus, le patron d’expression de la fibrilline-2 et de l’élastine était similaire à celui présent dans la peau normale humaine. Nous concluons donc que notre modèle est un outil prometteur pour étudier la maturation et l’organisation du réseau de fibres élastiques.
Subventionné réseau ThéCell du FRQS et IRSC.
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