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104 - Séquençage à haut débit et bioinformatique : besoins, enjeux et défis en pays en voie de développement

Le lundi 7 mai 2018

Le séquençage à haut débit (SHD) regroupe des technologies dont les applications de plus en plus diversifiées répondent à de nombreuses problématiques en recherche comme en clinique avec l’avènement des thérapies personnalisées. Ces technologies connaissent encore aujourd’hui des progrès fulgurants afin de les rendre plus accessibles en matière de coût et de manipulation. Elles impliquent cependant un besoin strict en ressources humaines d’expertise adéquate pour produire et traiter les données de SHD. Quoique désormais moins dispendieux qu’à ses débuts, le SHD entraîne tout de même des coûts et requiert des conditions de travail aux standards élevés difficiles à atteindre dans des régions en voie de développement comme en Afrique.

Les maladies infectieuses en zone tropicale posent souvent le problème de délai de réponse en santé publique. Cela dépend en partie de la capacité à identifier les pathogènes responsables lorsque ceux-ci ont émergé ou d’en anticiper l’émergence en amont afin de gérer au mieux les cas qui se présentent. Les émergences virales de ces dernières années en Afrique telles qu’Ebola en Afrique de l’Ouest en 2014 ou encore lZika en Afrique du Sud en 2016 en sont des exemples. Le domaine de la découverte de pathogènes se présente aujourd’hui comme une priorité de recherche pour lequel le SHD constitue un outil précieux. Nombre de pays en voie de développement, où les standards minimum requis font encore défaut, sont concernés.

Ce colloque offrira une série de communications abordant différents aspects des problématiques de santé et de recherche en Afrique auxquels le SHD peut contribuer à répondre. Nous visons ici une réflexion sur les enjeux du SHD, les défis qu’ils imposent et l’intérêt d’investir pour de telles technologies dans des régions où les ressources sont encore limitées.

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Remerciements

Nous remercions très chaleureusement l'ACFAS, l'UQAC et les organisateurs du congrès de nous avoir offert la chance d'animer ce colloque. Nous remercions également nos conférenciers invités ainsi que participants et présentateurs d'avoir répondu présents. Enfin nous remercions nos organismes subventionnaires d'avoir rendu possible cet événement.

Colloque
Section 100 - Sciences de la santé
Responsables
Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF)
Nicolas Berthet
Institut Pasteur
Andriniaina Andy Nkili Meyong
Centre International de Recherches Médicales de Francevile (CIRMF)
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Avant-midi
08 h 30 à 10 h 35
Communications orales
Enjeux du séquençage à haut débit en Afrique
Présidence/Animation : Ingrid Labouba (Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF))
Batiment : UQAC
Local : P1-6380
08 h 30
Mot de bienvenue
08 h 35
L’intégration du séquençage à haut débit dans la gestion des épidémies et la surveillance virale
Gary Kobinger (Université Laval)

L’épidémie à virus d’Ebola de 2014-2016 en Afrique de l’Ouest fut la première épidémie durant laquelle, le séquençage à haut débit (SHD) local fut utilisé à grande échelle. Les séquences virales obtenues furent cruciales pour l’identification de chaines de transmission atypiques, pour lesquelles aucun lien épidémiologique n’était disponible.

À la vue de l’apport du SHD durant la gestion de cette épidémie, nous avons décidé d’intégrer le SHD dans nos réponses contre les fièvres hémorragiques ainsi que dans nos activités de surveillance des pathogènes à fort potentiel épidémique en Afrique. Durant l’épidémie à virus d’Ebola de 2017 en République Démocratique du Congo, nous avons séquencé le virus d’Ebola obtenu d’individus infectés. Nous essayons également de séquencer le virus d’Ebola à partir de l’ARN de chauve-souris infectées. En plus de nos activités de surveillance et de diagnostic, nous avons mis au point une formation sur le SHD pour les chercheurs d’Afrique Centrale et de l’Ouest. Cette présentation résumera nos activités de diagnostiques, de surveillance virale et de formation liées au SHD.

Résumé
09 h 35
Epidémie nosocomiale de Monkeypox (variole du singe) en République Centraficaine
David Emmanuel Rivalyn Nakouné Yandoko (Institut Pasteur de Bangui), Emmanuel Lampaert (Médecins Sans Frontières - RCA), Séverin Gervais Njdapou (Ministère de la Santé, de l’Hygiène Publique et de la Population - RCA), Isabel Zuniga (Médecins Sans Frontières - RCA), Michel VAn Herp (Médecins Sans Frontières - RCA), Jean-Paul Fongbia (Ministère de la Santé, de l’Hygiène Publique et de la Population - RCA), Thomas Daquin Koyazegbe (Organisation mondiale de la santé - RCA), Benjamin Selekon (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Giscard Francis Komoyo (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Sandra Miriella Garba-Ouangole (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Casimir Manengu (Organisation mondiale de la santé - RCA), Jean-Claude Manuguerra (Institut Pasteur), Mirdad Kazanji (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Antoine Gessain (Institut Pasteur), Nicolas Berthet (Institut Pasteur)

Introduction: Le monkeypox (variole du singe) est une maladie infectieuse causée par le virus monkeypox, du genre Orthopoxvirus et de la famille des Poxviridae. Les principaux signes cliniques de monkeypox chez l'homme sont des lésions maculopapulaires qui apparaissent initialement sur le visage, la paume des mains, plante des pieds et dans la plupart des cas, se propage rapidement de manière centrifuge sur tout le corps.

Aspects cliniques: De décembre 2015 à janvier 2016, 10 cas de monkeypox ont été identifiés et signalés dans la sous-préfecture de Bangassou à l’est de la RCA. Les deux premiers cas cliniques sont survenus chez des enfants de 5 et 9 ans d’une famille de chasseurs. Le cas index, un garçon de 9 ans, a développé une éruption après avoir tué et découpé un rongeur connu localement sous le nom de "cibissi" et identifié comme Thryonomis. Il s’en est suivi une épidémie avec modes de transmission : familial, liés transports et aux soins de santé.

Résultats: La présence du virus monkeypox a été mise en évidence par la technique de PCR à partir du sang et de pus chez 3 patients, tandis que le virus a été détecté chez les trois patients plus un 4ème à partir de prélèvements de croûtes après inoculation sur cerveau de souriceaux nouveau-nés. La caractérisation de la souche a montré qu’elle appartient au génotype de virus circulant dans le bassin du Congo.

Conclusion: Nous rapportons pour la première fois la preuve formelle de la transmission interhumaine du monkeypox.

Résumé
09 h 55
HPV et cancer du col de l’utérus au Gabon: Profil d’intégration du génome viral dans les lésions cervicales
Andriniaina Andy Nkili Meyong (Centre International de Recherches Médicales de Francevile (CIRMF)), Pamela Moussavou – Boundzanga (Centre international de recherches médicales de Franceville (CIRMF) - GABON), Ingrid Labouba (Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF)), Imaël Hervé Koumakpayi (Institut de cancérologie de Libreville - GABON), Emmanuelle Jeannot (Institut Curie - FRANCE), Stéphane Descorps-Declère (Institut Pasteur), Xavier Sastre – Garau (Institut de cancérologie de Lorraine - FRANCE), Eric Leroy (Institut de recherche et développement - FRANCE), Ernest Belembaogo (Institut de cancérologie de Libreville - GABON), Nicolas Berthet (Institut Pasteur)

Introduction: Le cancer du col utérin est le plus fréquent et le plus létal chez la femme d’Afrique Sub-Saharienne. Les Virus du Papillome Humain (VPH)_ notamment 16 et 18_ en sont la cause majeure. Dans les lésions cervicales de haut-grade, le VPH est souvent intégré au génome des cellules – hôtes. Ici, nous explorons l’intégration du VPH chez des patientes gabonaises suspectées de lésions cervicales testées positives pour les types 16 et 18.

Méthodologie: 35 échantillons de frottis en milieu liquide ont été analysés. Les ADN en ont été extraits et ont servi à la préparation de banques d’ADN destinées à un séquençage à haut débit (SHD), enrichies en séquences viral par double-capture. Les données générées ont permis d’évaluer l’intégration virale.  

Résultats: L’intégration varie selon le grade cytologique ; 85.7% pour les carcinomes, les HSIL 71.4%, les ASCH 66.7%, les LSIL 60% et les ASCUS 30.8%. Dans les haut-grades cytologiques (carcinomes et HSIL) les VPH 16 et 18 représentent 92% des formes intégrées ; le 16 y est retrouvé à 71.4%. Des génotypes minoritaires (33, 51, 58, 59) ont été détectés dans des LSIL,  excepté le 59 qui a été identifié dans un HSIL. 10 génotypes (30, 35, 39, 44, 45, 53, 56, 59, 74, 82) ont uniquement été retrouvés sous forme épisomale.

Conclusion: Le niveau d’intégration du VPH semble varier avec le grade. Agrandir la cohorte d’étude permettrait d’évaluer son potentiel clinique comme biomarqueur moléculaire de la progression des lésions cervicales.

Résumé
10 h 15
Infection mixte de peste-des-petits ruminants et de dermatose nodulaire contagieuse chez les chèvres au Sud-Kivu, République Démocratique du Congo
Bwihangane Birindwa (Universite Evangelique en Afrique), Chege George Gitao (Université de Nairobi - KENIA), Patrick Ntagereka Bisimwa (Université 2 Evangélique en Afrique - RDC), Christopher Okafor (Centre de l'Institut international d'agriculture tropicale (IITA) - RDC), Caroline Lilly Bebora (Université de Nairobi)

Contexte: La peste des petits ruminants (PPR) et la dermatose nodulaire contagieuse sont des maladies virales endémiques aiguës de petits ruminants d'importance économique.

Objectif: Déterminer la prévalence de la co-infection entre les deux virus en République Démocratique du Congo, caractériser le virus de la dermatose nodulaire contagieuse en se basant sur le séquençage des gènes P32, RPO30, GPCR et établir la relation phylogénétique entre son gène P32 et celui de la protéine de fusion (F) du génome du virus de la PPR.  

Méthodologie: Des échantillons des tissus, d’écouvillons et du sang total ont été prélevés chez des chèvres asymptomatiques et symptomatiques de ces deux maladies au Sud Kivu, Est de la RD Congo. La réaction de polymerisation en chaine (PCR) en une seule étape et la transcriptase inverse en deux étapes (RT-PCR) ont été utilisées pour amplifier les gènes cibles. Les échantillons positifs ont été séquencés pour l'analyse phylogénétique.  

Résultats et Conclusion: Sur 150 animaux testés, 64,7% étaient positifs au PPR, 52,7% à la dermatose nodulaire contagieuse et 38,7% pour les deux. La comparaison par paires des nucléotides du gène P32 et du gène F a montré 99,75% de pourcentage d'identité au sein des séquences du virus de la dermatose nodulaire contagieuse, 96,95% pour le virus de PPR et 47,91% entre les séquences de ces deux virus. L’infection mixte de ces deux maladies est prévalente en RD Congo.  

Résumé
10 h 35
Pause
10 h 50 à 12 h 15
Communications orales
Applications du séquençage à haut débit et impact sur la santé en Afrique
Présidence/Animation : Ingrid Labouba (Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF))
Batiment : UQAC
Local : P1-6380
10 h 50
Techniques de biologie moléculaire: outils de traçabilité de viande de brousse de Cephalophus callipygus Peters - 1876 et Cephalophus dorsalis Gray - 1846
Olivier Miantsia Fokam (Université de Dschang-FASA), Félix Meutchieye ( Université de Dschang - CAMEROUN), Tsi Angwafo Evaristus (Université de Bamenda - CAMEROUN), Robert Skilton (Biosciences eastern and central Africa Hub ILRI - KENIA), Apollinaire Djikeng (Biosciences eastern and central Africa Hub ILRI - KENIA)

L’objectif de cette étude était de déterminer les séquences des gènes qui codent pour le cytochrome C oxydase et montrer comment on peut les utiliser pour identifier les animaux. Les méthodologies utilisées étaient les techniques de biologie moléculaire basées sur le code barre ADN. Les résultats obtenus indiquent que les espèces exploitées comme viande de brousse ont été identifiées. Le Cephalophus dorsalis présente une sous unités Cytochrome C Oxydase mitochondrien issu de la séquence 1 un nombre égal  de 608 et rangée de 129 à 608. Elle a une longueur de 655pb et un degré de similarité de 92%,  avec 1% de gaps. Le Cephalophus callipygus présente une sous unités Cytochrome C Oxydase mitochondrien issu des séquences 2  un nombre égal  de 658 et rangée de 12 à 672. Elle a une longueur de 663pb et un degré de similarité de 98%,  avec 0% de gaps. Ces outils ont un impact positif sur la gestion de la faune avec la description soit de nouvelles espèces ou bien de clarification d’espèces connues, soit la traçabilité des animaux. Les séquences d’ADN des animaux et leurs sous unités Cytochrome C Oxydase sont des informations complémentaires contribuant à l’identification des animaux. De ces résultats, nous pouvons déduire que les techniques de biologie moléculaire sont un outil de traçabilité de la faune sauvage.  

Résumé
11 h 10
Caractérisation moléculaire de 7 souches de virus Monkeypox isolés en République centrafricaine entre 2001 et 2015
Nicolas Berthet (Institut Pasteur), Andriniaina Andy Nkili Meyong (Centre International de Recherches Médicales de Francevile (CIRMF)), Emmanuel Nakouné Yandoko (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Benjamin Selekon (Institut Pasteur de Bangui - RCA), Ingrid Labouba (Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF)), Antoine Gessain (Institut Pasteur), Jean-Claude Manuguerra (Institut Pasteur)

Introduction : La variole du singe est une zoonose causée par le virus du monkeypox (MPXV). La plupart des cas humains d’infection à MPXV recensés sont survenus en Afrique centrale, principalement République démocratique du Congo (RDC). Cependant des cas ont également été signalés en Afrique de l'Ouest et aux États-Unis pour la première fois en 2003. Ici nous avons séquencé et caractérisé sept souches différentes de MPXV provenant de cas individuels et de petits foyers épidémiques en République Centrafricaine (RCA).

Méthodes : Des banques d'ADN ont été préparées à partir d’échantillons biologiques puis enrichies en séquences MPXV par capture. Ces dernières ont été séquencées à l’aide de la plateforme Illumina (MiSeq) du CIRMF – GABON. Les lectures pairées obtenues ont été nettoyées et filtrées selon la qualité et la taille. Les génomes entiers MPXV ont été obtenus après mapping sur le génome de référence de RDC. Les prédictions de protéines ont été faites par FraGeneScan et leur identification a été confirmée par BLASTX. Un alignement multiple des polymorphismes ou Indels identifiés pour chaque souche a aussi été fait.

Conclusions: Nos analyses indiquent que les 7 génomes séquencés sont distincts. Cela suggère qu’entre 2001 et 2015, différentes souches issues de divers réservoirs animaux ont circulé en RCA. Des analyses plus approfondies pourraient permettre l’identification de potentiels motifs propres au réservoir animal, encore méconnu, dont les MPXV proviennent.

Résumé
11 h 30
Construction d’un pipeline d’analyse métatranscriptomique dédié à l’exploration des insectes vecteurs en Afrique
Vanesa BOUKOUBA (Université de Rouen), Nicolas Berthet (Institut Pasteur), Judicaël Obame - Nkoghe (Centre international de recherches médicales de Franceville (CIRMF) - GABON), Christophe Paupy (Institut de recherche et développement (IRD) - FRANCE), Eric Leroy (Institut de recherche et développement (IRD) - FRANCE), Catherine Dauga (Institut Pasteur - FRANCE)

Les nouvelles technologies de séquençage permettent d’explorer de nouveaux écosystèmes naturels, mais l’analyse de ces grands jeux de données complexes nécessite l’optimisation des pipelines bioinformatiques.  

Dans les grottes d’Afrique centrale, les chauves-souris coexistent avec de nombreux insectes impliqués dans le cycle naturel des arbovirus et des hématozoaires. L’objectif de notre étude est d’identifier la nature et les fonctions actives des communautés microbiennes portées par ces insectes, en milieu cavernicole éloigné de l’activité humaine. Nous avons développé un pipeline pour l’étude du catalogue des ARNs oumétatranscriptomes des moustiques. Conçu pour être utilisé en local, il inclut une méthode de réduction exacte et une étape de soustraction in silico pour réduire la taille des échantillons. Il inclut des outils d’identification des ARNr 16S, 18S, 23S et 28S et des outils d’annotation fonctionnelle des ARNm. Sa performance a été évaluée sur 3 réplicats techniques et 18 jeux de paramètres tests. Comparé à une application web existante, ce pipeline montre une très bonne efficacité en temps d’analyse, une facilité d’accès aux paramètres, une bonne reproductibilité et précision d’analyse, et une meilleure lisibilité des résultats.  

L’analyse d’un premier jeu de donnés révèle l’expression des gènes de microorganismes environnementaux et aussi de bactéries, virus et parasites, responsables de maladies infectieuses endémiques dans la région.  

Résumé
11 h 50
Plateforme de séquençage à haut débit en Afrique Centrale : une réalité au CIRMF - GABON
Ingrid Labouba (Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF))

Introduction: L'émergence de virus pathogènes en Afrique ces dernières années place la découverte de pathogènes comme un domaine prioritaire pour l’ensemble du continent. Aujourd’hui le diagnostic moléculaire inclut la détection du virus de même que son identification et sa caractérisation. Lors d’épidémies, l’efficacité de réponse dépend de la rapidité d’identification du pathogène en cause. Avoir in situ de toute la logistique requise pour le traitement d’échantillons constitue un atout majeur.

Contexte: Les méthodes usuelles de diagnostic moléculaire limitent le champ d’investigation à des cibles connues qui rend le diagnostic de cas négatifs fastidieux. Le séquençage à haut débit (SHD) offre les outils nécessaires à une caractérisation plus complète des pathogènes détectés et une exploration moléculaire approfondie, sans à priori, des cas d’étiologie inconnue. En Afrique, l’accès au SHD est rendu possible par l’export d’acides nucléiques à des fins d'analyses en externe. Outre le risque biologique et la perte de temps associés, il en résulte la fuite de biomatériel exploitable qui amoindrit les possibilités de recherches locales.

Objectifs: Pour mieux répondre aux besoins en santé et en recherche au Gabon, le CIRMF s’est muni d’une plateforme SHD qui offre une autonomie précieuse pour le diagnostic et la surveillance épidémiologique des maladies infectieuses. Nous présenterons ce plateau technique et des exemples pratiques de son utilisation en diagnostic et en recherche.

Résumé
12 h 10
Mot de clôture